操作指南

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產(chǎn)品說(shuō)明
細胞核中的DNA為負超螺旋結構,而且很致密,通常DNA雙鏈以組蛋白為核心,盤(pán)旋而形成核小體。當用去污劑破壞細胞膜和核膜,用高濃度鹽提取組蛋白,DNA殘留而形成類(lèi)核。如果類(lèi)核中的DNA有斷裂,斷裂點(diǎn)將引起DNA致密的超螺旋結構松散,在類(lèi)核外形成一個(gè)DNA暈圈。將類(lèi)核置于電場(chǎng)中電泳,DNA斷片可從類(lèi)核部位向陽(yáng)極遷移,經(jīng)熒光染色后,在陽(yáng)極方向可見(jiàn)形似彗星的特征性圖像,故稱(chēng)"彗星試驗"。彗星尾部即為遷移出類(lèi)核的DNA片段。此時(shí)彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴重,導致DNA超螺旋結構越松散,產(chǎn)生的斷裂點(diǎn)越多,DNA片段越小,從而在彗星尾部出現的DNA斷片越多,則慧尾的長(cháng)度、面積和熒光強度越大。通過(guò)測量彗星尾部的長(cháng)度、面積或熒光強度等指標,可以對DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析。本產(chǎn)品試劑及操作經(jīng)過(guò)優(yōu)化改良,操作簡(jiǎn)便,使用普通載玻片即可進(jìn)行,不需要使用磨砂玻片,操作過(guò)程中不易掉片;一次性制備大量樣本,做好的片子可長(cháng)期保存,解決了傳統操作中易掉片,不易保存等問(wèn)題。
試劑盒組成(略)
注意
1. 細胞裂解液、堿性電泳緩沖液,應根據需求,現配現用。
2. PI染液應避光低溫保存,染色時(shí)也應在暗處進(jìn)行操作
需要自備的試劑、耗材與儀器
試劑:堿性電泳緩沖液(1mM EDTA,300mM NaOH)(現配現用)、PBS、無(wú)水乙醇; 耗材:1.5 ml 管、載玻片、22×22mm及24×24mm蓋玻片 儀器:恒溫干燥箱、微量移液器、水浴鍋、水平電泳儀 實(shí)驗前準備:
0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖溶液:向裝有正常熔點(diǎn)瓊脂糖粉末的瓶中加6 ml PBS,微波爐加熱溶解,45℃水浴
鍋放置; 0.7%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液:向裝有低熔點(diǎn)瓊脂糖粉末的瓶中加4.3ml PBS,沸水浴中加熱直至完全溶解(或微波高火30s,取出搖勻,再次高火10-30s,直至溶解),37℃水浴鍋放置。 1×中和液:根據實(shí)驗需求,將10×中和液與蒸餾水按1:9比例稀釋?zhuān)庞?℃冰箱預冷后使用。
實(shí)驗步驟
1、新鮮收集的細胞用冰冷的PBS洗一次,離心收集,PBS重懸使其密度為 1x106個(gè)/mL;
2、鋪膠:下述各濃度瓊脂糖凝膠均用 PBS 配制,
第 1 層凝膠的制備:取干凈的載玻片,滴加100ul 45℃預熱的0.5%正常熔點(diǎn)瓊脂糖,加22×22mm蓋玻片,4℃放置3 min,待膠凝固后,推去蓋玻片,于60℃烘箱烤30min,直至膠完全干透,此時(shí)片子可室溫干燥條件下密封保存一周。 第 2 層凝膠的制備:取已鋪好第一層膠的玻片,將 10μL細胞(約 10 4 個(gè))和 75μL 37℃預熱的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖混合均勻。迅速將含細胞的瓊脂糖滴到第1層瓊脂糖上,立即蓋上另一干凈蓋玻片(22×22mm),置 4℃ 2 min 使第2 層 LMA 凝固。 第 3 層凝膠的制備:第 2 層凝固后,在室溫下小心移去蓋玻片,滴加預熱 37℃的75μL的 0.7%低溶點(diǎn)瓊脂糖,如上蓋上蓋玻片(22×22mm),4℃下凝固2 min。
3、細胞裂解 移去蓋玻片,將玻片置于平皿中,倒入預冷的細胞裂解液(使用前每 9mL加入 1mL 的 DMSO),4℃裂解 1~2h,取出載玻片用 PBS 漂洗。
4、DNA堿解旋 將載玻片置于水平電泳槽。倒入新配制的堿性電泳緩沖液,約覆過(guò)載玻片膠面 0.25cm 左右,室溫放置 20~60min,以便使DNA在堿性條件下解螺旋和產(chǎn)生堿易變性區段,使DNA斷鏈在電場(chǎng)中易于遷移。
5、單細胞電泳 在電壓 25V下,電泳 20-30 min。
6、中和 電泳后將載玻片置于平皿內。加入中和緩沖液,將載玻片沒(méi)入,4℃中和三次,每次 10min,棄去 Tris-HCl 緩沖液。
7、脫水干燥 將片子浸入無(wú)水乙醇中15min,重復兩次,然后取出晾干,直至膠完全干透變薄,4℃下避光保存。
8、取出片子,滴加20 ul PI染液,蓋上蓋玻片,室溫染色10 min,顯微鏡下觀(guān)察拍照。
9、隨機選擇100個(gè)細胞,通過(guò)軟件(如CASP)測量彗星頭部直徑和尾長(cháng),根據尾長(cháng)和頭部直徑比值,估計DNA的損傷程度。


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