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凝膠遷移試劑盒操作說(shuō)明書(shū) (EMSA)
作者:Exonlab 發(fā)布于:2022/8/18 16:54:02 點(diǎn)擊量:

凝膠遷移試劑盒(EMSA Kit

貨號:R5130                               規格:50T

本試劑盒室溫運輸,4℃儲存。

 

試劑盒介紹:

電泳遷移率遷移分析,簡(jiǎn)稱(chēng)為“凝膠遷移”“EMSA”,生物素標記的DNA片段將含有特定DNA位點(diǎn)與DNA結合蛋白一起孵育。蛋白質(zhì)DNA 通過(guò)非變性電泳將復合物與游離DNA分離,利用聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質(zhì)阻礙了結合的DNA片段的遷移。從而導致游離的DNADNA-蛋白質(zhì)復合物遷移更快。凝膠結果揭示游離和結合的生物素標記DNA的位置。

試劑盒成份:

1、Bovine serum albumin (BSA; 50μg/μL,5%)

2、Buffer A

3、DNA loading bufferbromophenol blue

5、DTT; 0.1 M

6、0.5× TBE and 1% glycerol

7、Glycerol (20% v/v)

8、MgCl2 (0.1 M)

9、Poly(dI-dC) (1 μg/μL)

10、TBE buffer (5×)

自行準備如下試劑:

1、  TEMED

2、  Gel-fixing solution (20% methanol and 10% acetic acid)

3、  Acrylamide mix (30%;acrylamide:bisacrylamide, 29:1)

4、  Ammonium persulfate (10%)

5、  Binding protein (0.5100 ng/μL)

6、  親和素-HRP

簡(jiǎn)略步驟

1.    準備40 mL4.5%丙烯酰胺凝膠。

丙烯酰胺混合物6.0 ml;

TBE緩沖液(5×)4 mL;

甘油(20%)2ml;

H2O 28ml;

過(guò)硫酸銨(10%)300μL。

2.    在倒入之前,添加30μL TEMED,搖動(dòng)均勻。

3.    倒入凝膠。

4.    10 mA下將凝膠預電泳2小時(shí)。

5.    0.5 mL微量離心管中加入:

*EMSA結合Buffer20μL;(可直接購EMSA 5X buffer

1)重組蛋白(0.5100 ng /μL2.00μL;

2)生物素標記的DNA1 fmol /μL2.00μL;

3)聚dI-dC1μg/μL0.40μL;

4)牛血清白蛋白(50μg/μL0.50μL;

5DTT0.1 M0.20μL;

6)氯化鎂(0.1 M1.50μL

7)緩沖液D  13.40μL

     備注:上述樣品可以等體積擴大。

6.    將樣品在30°C下孵育1小時(shí)或在室溫2小時(shí)。

7.    非常小心地將樣品直接加樣(即不添加染料)到樣品池孔的底部。10mA條件,啟動(dòng)電源4.5%天然聚丙烯酰胺凝膠。加入少量(例如5μL)的DNA上樣緩沖液。

8.    溴酚藍大約在凝膠的三分之二處遷移。通常運行4-6小時(shí)就足夠了,取決于DNA片段的大小。

9.    凝膠電泳完成后,小心除去緩沖液。取出凝膠。拆下墊片并分離板,保持凝膠附著(zhù)在一塊板上。

10.  將凝膠浸泡在親和素-HRP溶液(1:500稀釋?zhuān)┲,可用塑料袋。在凝膠固定溶液中固定15分鐘。

11.  將凝膠放在兩張吸水紙上。用保鮮膜覆蓋凝膠的頂部,在凝膠干燥器上于70°C放置1小時(shí)。

12.  將干燥的凝膠暴露在HRP顯影液中,曝光顯影。

 

原因排除

問(wèn)題:沒(méi)有綁定條帶。

解決:通常表明該蛋白質(zhì)未濃縮或未結合該位點(diǎn),或緩沖液條件與電泳過(guò)程中的蛋白質(zhì)結合不兼容。嘗試更大蛋白質(zhì)濃度,改變緩沖液pH和鹽濃度,替代電泳運行緩沖液,或在較冷的房間中于4°C運行凝膠。

問(wèn)題:條帶過(guò)多。

解決:額外的條帶通常是由非特異性結合引起的。嘗試添加更少的蛋白質(zhì)而更多DNA探針。

問(wèn)題:凝膠不干凈。

解決:表明電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)解離,而電泳中蛋白質(zhì)過(guò)多。反應或在太高的溫度下電泳凝膠。電泳更多的凝膠慢慢地,降低蛋白質(zhì)濃度,嘗試在冷室中運行凝膠,改變緩沖液條件,或添加更多競爭者DNA。

     

EMSA相關(guān)試劑:

EMSA/Gel-Shift 結合5XBuffer

貨號:R5130-1

儲存:-20

體積:300μl

EMSA/Gel-Shift 結合緩沖液(5X) buffer 成份

10×binding buffer  

Poly(dI.dC)

魚(yú)鮭精DNA   

50% 甘油   

100uM MgCl2 

10% NP-40 

使用步驟:

見(jiàn)本公司EMSA試劑盒說(shuō)明書(shū),同其他廠(chǎng)家試劑盒通用。

 

EMSA loading buffer (10X)

貨號:R5130-2

儲存:-20

體積:1 ml

EMSA Loading buffer 成份,

Ficol 400

未添加苯青和溴酚藍指示劑

使用步驟:

見(jiàn)本公司EMSA試劑盒說(shuō)明書(shū),同其他廠(chǎng)家試劑盒通用。

 

EMSA loading buffer (10X,含染料)

貨號:R5130-3

儲存:-20

體積:1 ml

EMSA Loading buffer 成份,

Ficol 400

添加苯青和溴酚藍指示劑

使用步驟:

見(jiàn)本公司EMSA試劑盒說(shuō)明書(shū),同其他廠(chǎng)家試劑盒通用。

 

Poly(dI-dC) (1 μg/μL)

貨號:R5130-4

儲存:-20

體積:100μl

 

EMSA 生物素結合探針(訂制)

貨號:R5130-X

儲存:-20

體積:500μl

 

TBE buffer 5X

貨號:R5130-5

儲存:-24

體積:100ml

 

50% 甘油 滅菌

貨號:R5130-6

儲存:-24

體積:10ml


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